PRÁCTICA Nº 3

Omnipresencia de hongos en ambientes naturales.

Dalila Montañez

Alcibiades Garibaldo

Objetivos generales:

Ø  Demostrar la presencia de los microorganismos en todos los ambientes que nos rodean.

Ø  Destacar la importancia de la omnipresencia de los microorganismos en muestras de suelo, agua, aire y cuerpo humano.

Introducción

Los microorganismos se encuentran distribuidos sobre todos los ambientes que encontramos en nuestro planeta, de allí podemos atribuir el término de omnipresencia.

El agua en condiciones naturales contiene un gran número de microorganismos entre los cueles podemos  señalar  a los hongos. De todos los ambientes,  el suelo es el que contiene la mayor diversidad de microorganismos, estos contaminan la superficie e interior de las plantas que crecen sobre el mismo. Las corrientes de aire y el polvo constituyen una fuente importante de contaminación del medio ambiente, los principales microorganismos que podemos encontrar presentes lo constituyen microorganismos patógenos, especialmente causantes de infecciones respiratorias.

Uno de los métodos más simples para detectar microorganismos presentes en el aire es exponer un plato petri abierto el cual contiene un medio de cultivo apropiado para el crecimiento de microorganismos como bacterias y hongos, el mismo se deja abierto por varios minutos o inclusive se puede dejar hasta por 2 horas, este procedimiento se conoce como método de placa fija.

Como la cantidad de microorganismos que encontramos presentes en algunos tipos de muestras ciertas veces es tan elevada, debemos  de recurrir a las diluciones de las muestras con la finalidad de determinar el UFC de la muestra.

Materiales

13 platos petri con agar papa dextrosa

1 botella de vidrio  con 90 ml de agua peptonada estéril

Muestra de suelo

10 tubos con rosca con 9 ml de agua peptonada estéril

11 pipetas estériles de 1 ml

Espátula

Levadura en bolita

Un tubo de ensayo con agua azucarada

Porta objetos

Cubre objetos

Safranina

Muestra de agua estancada

Procedimiento

A.      Muestra ambiental- Aire

1.      Tome 4 platos petri con agar papa dextrosa

2.      Coloque uno de los platos sin tapa sobre la mesa de trabajo por 15 minutos, otro plato coloque lo  abierto sobre el piso por 30 minutos, el siguiente plato colóquelo abierto por 15 minutos a la entrada del edificio y el último plato colóquelo sin tapa en el piso a la entrada del edificio por 30 minutos.

3.      Transcurrido el tiempo de muestreo cierre los platos e incúbelos de 3 a 5 días a temperatura ambiente.

4.      Haga las observaciones macroscópicas y microscópicas de las colonias que se desarrollan en los platos.

5.      En el caso del crecimiento de hongos unicelulares realice la tinción de Gram, y en el caso de crecimiento de hongos filamentosos realice un frotis con azul de lactoglicerol.

B.       Dilución de suelo

1.      Pese 10 g de suelo seco y añádalo a una botella que contenga 90 ml de agua peptonada estéril. Esta será la primera dilución es decir 10^-1 o 1:10

2.      Agite la botella de 3 a 5 minutos

3.      Utilizando una pipeta estéril transfiera 1 ml de la primera dilución (10^-1) a un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada estéril. Rotule inmediatamente después, esta será la dilución 10^-2 o 1:100.

4.      Las siguientes diluciones serán preparadas de la misma forma como lo hizo en el paso anterior.

5.      Las diluciones deben ser preparadas hasta 10^-6.

6.      Con la pipeta que utilizó para preparar la dilución 10^-2 transfiera 0.1 ml de la dilución 10^-1 a un plato petri con agar papa dextrosa el cuál identificará como 10^-1.

7.      Con un esparcidor de metal o de vidrio estéril proceda a distribuir la muestra sobre la superficie del medio de cultivo.

8.      Con la pipeta que preparó la dilución 10^-3 transfiera 0.1 ml de la dilución

10^-2  a un plato petri rotulado como 10^-2. Así sucesivamente prepare los platos hasta llegar a la dilución de 10^-6.

9.      Incube los platos en posición invertida a una temperatura que oscila entre 26 y 28ºC. Realice una revisión de los platos 3 días después de iniciado el ensayo y anote sus resultados. Recuerde que los hongos filamentosos requieren de 3 a 5 días para su incubación.

C.      Hongos unicelulares- Levaduras

1.      Con una espátula limpia tome una porción de levadura seca activa y deposítela en un tubo con agua azucarada estéril.

2.      Déjelo reposar por algunos minutos y observe algún cambio aparente

3.      Con un asa bacteriológica proceda a tomar una muestra y deposítela sobre un porta objeto limpio donde previamente ha colocado una gota de colorante safranina.

4.      Inmediatamente coloque un cubre objeto sobre la preparación

5.      Observe al microscopio con el objetivo de alto poder, describa lo observado.

6.      Trate de buscar células en fase reproductiva (gemación)

D.     Hongos dermatofitos

1.      En 3 platos petri conteniendo agar papa dextrosa inocule en cada uno muestras de cabellos, uñas y piel.

2.      Incubar los platos rotulados, a temperatura ambiente de 3 a 5  días.

3.      Haga sus observaciones sólo macroscópicamente.

E.      Recuento de hongos filamentosos y levaduras- Técnica de Petrifilm

1.      Adicione 1 ml de la muestra de agua estancada en 9 ml de agua peptonada estéril, homogenizar la muestra por 2 minutos. Rotule como dilución 1:10 o 10^-1.

2.      Del  tubo 10^-1 con una pipeta estéril transfiera 1 ml de la muestra y deposítelo en un tubo que contiene 9 ml de agua peptonada estéril, marcar el tubo como 1:100 o 10^-2.

3.      Continúe diluyendo hasta 10^-5.

4.      Vierta 1 ml de cada dilución en el centro de placas petrifilm para levaduras y hongos filamentosos. Déjela solidificar e incúbelas a temperatura ambiente por 3 a 5 días.

5.      Luego proceda a observar y contar el número de colonias crecidas y seleccione el plato que contiene entre 15 y 150 colonias para determinar el número de microorganismos por gramo de la muestra.