PRÁCTICA
Nº 4
ALIMENTOS CON BAJA ACTIVIDAD DE AGUA (aw)
Dalila Montañez
Objetivos
- Determinar el
número de hongos presentes en la muestra evaluada por recuento total placas de
Agar Papa Dextrosa (PDA) o por técnica de Petrifilm para levaduras y mohos.
Introducción
El agua, es un
elemento esencial para la vida, es además uno de los principales componentes de
los alimentos y, por sí sola, un factor determinante para su conservación y
seguridad. El ataque de los microorganismos es la principal causa de deterioro
y su crecimiento está ligado a la cantidad de agua que contiene el alimento.
La actividad de
agua (aw) es la cantidad de agua libre en el alimento, es decir, el agua
disponible para el crecimiento de microorganismos y para que se puedan llevar a
cabo, diferentes reacciones químicas. Tiene un valor máximo de 1 y un valor
mínimo de 0. Cuanto menor sea este valor, mejor se conservará el producto. La
actividad de agua está relacionada con la textura de los alimentos: a una mayor
actividad, la textura es mucho más jugosa y tierna; sin embargo, el producto se
altera de forma más fácil y se debe tener más cuidado.
A medida que la
actividad de agua disminuye, la textura se endurece y el producto se seca más
rápido. Por el contrario, los alimentos cuya actividad de agua es baja por
naturaleza son más crujientes y se rompen con facilidad. En este caso, si la
actividad de agua aumenta, se reblandecen y dan lugar a productos poco
atractivos. En ambos casos, el parámetro de la actividad de agua del alimento
es un factor determinante para la seguridad del mismo y permite determinar su
capacidad de conservación junto con la capacidad de propagación de los
microorganismos.
Agua y microorganismos
Controlar la actividad
de agua (aw) en alimentos es sinónimo de alargar su vida útil. Cuanto menor es
la actividad de agua de un alimento, mayor es su vida útil. Es importante
diferenciar entre cantidad de agua y actividad de agua. El primer término hace
referencia a la cantidad total de agua presente en el alimento, aunque puede
ser que no esté libre para interaccionar. La actividad de agua, en cambio, hace
referencia solo a la cantidad de agua libre en el alimento y disponible para
reaccionar, es decir, la que puede facilitar la contaminación del producto.
El contenido en
agua de los alimentos es muy variado. Según datos de Jose Mataix Verdú,
fisiólogo de la Universidad de Granada, los alimentos que más agua contienen
son las hortalizas (hasta un 95%) seguidas de la frutas (hasta un 91%), el
yogur (86%), el pescado blanco (82%) y, en quinta posición, los huevos (75%).
Completan el top ten los mariscos (79%), el pollo (67%), el jamón (67%), el
pescado azul (64%) y las vísceras como el hígado (hasta 60%). Los alimentos que
menos agua contienen son las galletas (2,5%), las legumbres (11%) y el arroz
(11,4%).
Los alimentos
con baja aw se conservan en óptimas condiciones durante períodos más largos de
tiempo. Por el contrario, aquellos cuya actividad de agua es elevada están
sometidos a contaminación microbiológica y su conservación es mucho más
delicada. Por esta razón, en alimentos más perecederos se utilizan técnicas de
conservación como la evaporación, secado o liofilización para aumentar así su
vida útil. La actividad de agua es un parámetro que establece el inicio o final
del crecimiento de muchos microorganismos. La mayoría de patógenos requieren
una aw por encima de 0,96 para poder multiplicarse. Sin embargo, otros pueden
existir en valores inferiores. Algunos hongos son capaces de crecer en valores
inferiores a 0,6.
aw = 0,98: pueden crecer
casi todos los microorganismos patógenos y dar lugar a alteraciones y
toxiinfecciones alimentarias. Los alimentos más susceptibles son la carne o
pescado fresco y frutas o verduras frescas, entre otros.
aw = 0,93/0,98: hay poca
diferencia con el anterior. En alimentos con esta aw pueden formarse un gran
número de microorganismos patógenos. Los alimentos más susceptibles son los
embutidos fermentados o cocidos, quesos de corta maduración, carnes curadas
enlatadas, productos cárnicos o pescado ligeramente salados o el pan, entre
otros.
aw = 0,85/0,93: a medida que
disminuye la aw, también lo hace el número de patógenos que sobreviven. En este
caso, como bacteria, solo crece S. aureus, que puede dar lugar a toxiinfección
alimentaria. Sin embargo, los hongos aún pueden crecer. Como alimentos más
destacados figuran los embutidos curados y madurados, el jamón serrano o la
leche condensada.
aw = 0,60/0,85: las bacterias
ya no pueden crecer en este intervalo, si hay contaminación se debe a
microorganismos muy resistentes a una baja actividad de agua, los denominados
osmófilos o halófilos. Puede darse el caso en alimentos como los frutos secos,
los cereales, mermeladas o quesos curados.
aw <0,60: no hay
crecimiento microbiano, pero sí puede haber microorganismos como residentes
durante largos periodos de tiempo. Es el caso del chocolate, la miel, las
galletas o los dulces.
Controlar la actividad de agua
Controlar la
actividad de agua en los alimentos es sinónimo de alargar su vida útil. Al
conseguir una disminución de la cantidad total de agua libre, se disminuyen
notablemente las probabilidades de contaminación microbiana. No todos los
alimentos requieren los mismos cuidados. La miel no precisa cuidados extras; en
cambio, alimentos como el pescado poco salado o los frutos secos más húmedos
(higos) son más perecederos. En este caso, sí es importante el control de la
actividad de agua.
Las dos maneras
más importantes de reducir la actividad de agua de los alimentos pasan por el
secado y la incorporación de sal o azúcar para atrapar las moléculas de agua.
El primer método es el más antiguo y, además de secar, también ayuda a formar
aromas y sabores típicos en los alimentos procesados con este método. Según el
tipo de alimentos, se utiliza uno u otro mecanismo de secado: para alimentos
sólidos como vegetales, frutas o pescado, se utiliza el secado con aire
caliente; para líquidos como la leche, el secado por aspersión; para mezclas
pastosas líquidas, el secado al vacío; y para una amplia variedad de productos,
el secado por congelación.
Otro método
consiste en agregar sal o azúcar a los alimentos. Este no requiere máquinas
especializadas, pero sí debe tenerse mucho cuidado durante su procedimiento. Se
añade azúcar en las mermeladas o concentraciones de salmuera en las carnes para
disminuir la actividad de agua. El producto terminado debe evaluarse para
determinar en cifras su actividad de agua.
Las harinas como
otros cereales deben tener un contenido bajo de humedad, de aproximadamente 13%
o inferior y generalmente son tratadas con un agente oxidante (óxido nitroso,
cloro, cloruro de nitrosilo o peróxido de benzoilo), lo que reduce tanto el
número como la clase de microorganismos que pueden estar presentes en el
producto final. Deben almacenarse a temperaturas entre 4.0 y 7.0 °C, y en recipientes cerrados que no sean accesibles a insecto,
roedores u otros organismos. En las harinas podemos encontrar esporas de hongos
pertenecientes a los géneros Aspergillus,
Penicillium, Cladosporium y Alternaria,
frecuentemente observadas. Por otro
lado, hay bacterias pertenecientes a las familias Pseudomonadaceae,
Micrococcacease, Lactobacillaceae y Bacillaceae que proceden primordialmente
del grano, desde la colecta. Las esporas de Bacillus,
algunos coliformes y representantes de los géneros Achromobacter, Flavobacterium.
Sarcina, Micrococcus, Alcaligenes
y Serratia, también se pueden
encontrar.
Desde tiempos
muy remotos la humanidad utiliza hierbas, especias y condimentos muy diversos
para numerosos fines. En la cocina, las partes delicadas de las hierbas como
las hojas y flores se clasifican como hierbas, mientras que los extractos
aromáticos secos, semillas y raíces se conocen como especias. Las hierbas, especias
y condimentos al igual que la harina deben conservarse en recipiente cerrado,
preferiblemente en lugares frescos y secos. Para un almacenamiento prolongado se
recomienda efectuarlos a una temperatura de aproximadamente 0°C por período no
mayores de 18 meses. También deben tener un contenido bajo de humedad, de
aproximadamente 13% o inferior y ser tratados con un agente oxidante (óxido
nitroso, cloro, cloruro de nitrosilo o peróxido de benzoilo), los cuales reduce
la carga de microorganismos que pueden estar presentes en el producto final. Las especias que se encuentran en el comercio
tienen, en general, un contenido microbiano relativamente bajo, que puede
variar de unos pocos microorganismos por gramo, a vario cientos, con
predominancia de esporas bacterianas. Las esporas de lo género Bacillus, y Clotridium, cuya destrucción exige la esterilización por calor
húmedo plantea dificultades en la fabricación de embutido cocido y otros
productos cárnicos. Los recuentos de esporas bajos son importantes si estas especias
se van a utilizar para la elaboración de productos enlatados. Además de las
bacterias esporuladas, las especias y condimentos contienen con frecuencia
bacterias pertenecientes los géneros: Stahylococcus,
Streptococcus, Psedumonas, Flavobacterium. Achromobacter Klebiella, Serratia y otros. En productos procedentes
de industrias cárnicas es posible encontrar Escherichia
coli, y algunas especies de Salmonella.
Rara vez se encuentran levadura, en cambio contienen numerosas especies de
esporas de hongos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Penicillium,
Cladosporium, Scopulariopsis y otros hongos particularmente en forma de esporas.
La carga microbiana
según el CODEX alimentario para el recuento de levaduras y hongos filamentosos.
Alimento
|
Recuento de levaduras y hongos
filamentosos
|
Harina trigo
|
Esporas de
hongos
50-100
|
Harina blanca
(Féculas y
almidones)
|
Mohos
103 a 104
UFC/g
|
Especias y
condimentos
|
Mohos
103 a 104
UFC/g
|
Materiales
- 1 muestra
de algunos de los siguientes alimentos: harina, especies o condimentos.
- 10 tubos
con 9 ml de agua peptonada estéril.
- 2 Botellas de
dilución con 225 ml ó 90 ml de agua peptonada estéril.
- 1 Botella
con 200 ml de agar papa dextrosa o placas Petrifilm para levaduras y
hongos filamentosos.
- Platos
Petri estériles
- 2 bolsas
estériles medianas (marca Ziploc)
- Espátula
estéril
- 15 Pipetas
estériles de 1ml.
- 2 Propipeta
para 1ml.
- 2 Esparcidores
de metal
- Alcohol al
70%
- Alcohol al
95%
- Balanza
analítica
- Baño María
a 45°C.
- Contador de
colonia (Quebec).
- Asa
microbiológica y asa micológica.
- Portaobjetos,
cubreobjetos, batería de colorantes para Gram y solución de montaje (Azul
de lactoglicerol).
- Aceite de
inmersión (cedro).
- Papel de
lente
- Microscopio
compuesto de campo claro
- Estereoscopio
Procedimientos
Ø Exposición
teórica: brevemente se hablará y abordara temas como los objetivos de la
práctica, materiales necesarios, los procedimientos, algunas definiciones,
tipos de técnicas.
Ø Preparación de
las diluciones seriadas y los análisis microbiológicos de los alimentos solicitados
(harina o especies). Incubación de los diferentes medios de cultivos y su
posterior observación, recuento e identificación de los resultados obtenidos.
I.- Método de Recuento de hongos filamentosos y
levaduras.
1. Pese 25 ó 10 g de la
muestra de alimento (harina, azúcar, especia o condimentos) seleccionada con
anterioridad en una bolsa estéril (Ziploc).
2.- Adicionar los 225 ml ó
90 ml de agua peptonada estéril y homogenizar la muestra por unos 2 minutos.
Rotule como dilución 1:10 ó 10-1.
3.- Del homogenizado
(dilución 1:10 ó 10-1) tome con una pipeta estéril 1 ml y deposítelo
en un tubo con 9 ml de agua peptonada estéril, mezcle cuidadosamente y rotule. Está dilución corresponde a 1:100 ó 10-2. Continúe diluyendo hasta obtener las siguientes diluciones
1:1000 ó 10-3 y 1:10000 ó 10-4.
4.- Vierta 0.1 ml de cada
dilución en un plato Petri de PDA previamente servido, que contienen 20 ml de
agar papa dextrosa (PDA) solidificados. Se debe aplicar la técnica de esparcido
por lo que se deben servir sobre la superficie del plato Petri con PDA unos 0.1
ml de cada dilución, recordando que para esta técnica la muestra se ha diluido
un décimo (1:10). En el caso de utilizar platos de Petrifilm se debe servir
sobre la superficie del film 1 ml de cada dilución, se deja caer el film y se
esparce con el aplicador proporcionado para este propósito. Incube a 25-26°C ó
a temperatura ambiente durante 3 a 5 días.
Luego proceda a contar el
número de colonia crecida y seleccione el plato que contenga de 20-200 colonias
para platos Petri o 15 a 150 colonias para placas de Petrifilm, con la
finalidad de determinar el número de microorganismo por gramo de muestra.
No. de microorganismo por gramo (m.o./g) = número de
unidades formadora de colonia (UFC) por dilución.
No.
m.o./g = No. UFC/dilución
Cuadro de resultados
Recuento
Microbiano
|
10-1
|
10-2
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
UFC/g
|
Observaciones
|
Agar Papa Dextrosa (PDA)
Recuento de hongos
filamentosos y levaduras.
|
|
|
|
|
|
|
|
Placa de Petrifilm para
hongos unicelulares y mohos.
Recuento de hongos
filamentosos y levaduras.
|
|
|
|
|
|
|
|
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Bauer D. Análisis Clínicos. Métodos e Interpretaciones. 1ª ed. Barcelona
España: Editorial Reverté 1986.
Benavides Martínez,
Heydi A. Propuesta de guía de aplicación
de técnicas de microbiología (bacterias y hongos) para ser utilizado en
Microbiología General. Universidad de El Salvador, San Salvador, El
Salvador, Centro América. 2007. 234 páginas.
Caballero Torres,
Ángel E. Temas de Higiene de los
alimentos. La Haba: Editorial Ciencias Médicas. 2008. 382 páginas.
Estrada, Heylin; Ganboa, María del
Mar; Chaves, Carolina; Arias, María Laura. Evaluación
de la actividad antimicrobiana de la miel de abeja contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes y Aspergillus niger. Evaluación de su
carga microbiológica. ALAN [online]. 2005, vol.55, n.2, pp. 167-171. ISSN
0004-0622.
Koneman E, Schrekeberger P, Janda A. Diagnóstico Microbiológico.
3ra ed. Argentina: Editorial Panamericana 1997.
Pascual Anderson,
María del Rosario; Calderón y Pascual, Vicente. Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y
Bebidas. Ediciones Díaz de Santos, 1999. 464 páginas.
Manipulación de
alimentos (Manual común). Junta de Andalucía. Servicio Andaluz de empleo.
Consejería de Empleo y Desarrollo Tecnológico.
Valdiviezo Lugo N, Villalobois LB, Martínez Nazaret R. Evaluación
microbiológica en manipuladores de alimentos de
tres comedores públicos en Cumana – Venezuela. Rev. Soc. Ven.
Microbiol. v.26 n.2 Caracas. 2006
